La estreptozotocina induce lesión tubular proximal renal a través de la activación de la señalización de p53

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8705 (2023) Citar este artículo

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La estreptozotocina (STZ), un fármaco contra el cáncer que se usa principalmente para tratar tumores neuroendocrinos (NET) en entornos clínicos, se incorpora a las células β pancreáticas o a las células epiteliales del túbulo proximal a través del transportador de glucosa, GLUT2. Sin embargo, sus efectos citotóxicos sobre las células renales se han subestimado y los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Aquí demostramos que el daño del ADN y la posterior señalización de p53 fueron responsables del desarrollo de la lesión epitelial tubular inducida por STZ. Detectamos daño en el ADN epitelial tubular en pacientes con NET tratados con STZ. La transcriptómica imparcial de células epiteliales tubulares tratadas con STZ in vitro mostró la activación de la vía de señalización de p53. STZ indujo daño en el ADN y activó la señalización de p53 in vivo de una manera dependiente de la dosis, lo que resultó en una reducción de los transportadores de membrana. La inhibición farmacológica de p53 y del transportador de sodio-glucosa 2 (SGLT2) mitigó la lesión epitelial inducida por STZ. Sin embargo, los efectos citotóxicos de STZ en las células β pancreáticas se conservaron en ratones tratados con inhibidores de SGLT2. Los presentes resultados demuestran la citotoxicidad específica del túbulo proximal de STZ y los mecanismos subyacentes in vivo. Dado que los efectos citotóxicos de STZ contra las células β no se vieron afectados por la dapagliflozina, el pretratamiento con un inhibidor de SGLT2 tiene potencial como remedio preventivo para la lesión renal en pacientes con TNE tratados con STZ.

La estreptozocina/estreptozotocina (STZ), un análogo de la glucosa, se clasifica como un fármaco anticancerígeno de agentes alquilantes y es una de las principales clases de fármacos citotóxicos que se utilizan principalmente para tratar tumores neuroendocrinos (NET)1,2. La STZ se incorpora a las células β pancreáticas a través del transportador de glucosa tipo 2 (GLUT2), lo que promueve el daño del ADN, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la disfunción mitocondrial y la posterior apoptosis3,4,5. Según los hallazgos de los ensayos clínicos, la combinación de STZ y 5-fluorouracilo se usa comúnmente para tratar pacientes con TNE bien diferenciados6,7.

Debido a la alta expresión de GLUT2 en el hígado y los riñones, los efectos secundarios comunes de STZ ocurren en estos órganos2,8. Además de la disfunción renal, a veces se desarrollan hipofosfatemia y glucosuria renal en pacientes tratados con STZ9. La glucosuria no diabética o la hipofosfatemia debida a hiperfosfaturia se deben a la disminución de los transportadores de sodio-glucosa o de los cotransportadores de sodio-fosfato, respectivamente, que se expresan predominantemente en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo proximal. Dado que la pérdida o disminución de los transportadores de la membrana del borde en cepillo es una respuesta inicial de la lesión renal aguda10,11,12,13, la glucosuria o la hipofosfatemia después del tratamiento con STZ pueden reflejar la lesión tubular proximal latente, que se subestima o ignora en entornos clínicos.

En campos experimentales, STZ se usa comúnmente como un agente diabetogénico para destruir las células β pancreáticas, lo que resulta en el desarrollo de diabetes tipo 114,15. Sin embargo, en los análisis de fenotipos renales en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ, una preocupación potencial es la toxicidad renal inducida por la administración de STZ14,15,16. Otra preocupación es que la susceptibilidad a STZ varía entre los tipos de roedores y los antecedentes genéticos15. Por lo tanto, optimizar la dosis o el horario de administración de STZ puede prevenir su nefrotoxicidad15; sin embargo, las dificultades están asociadas con establecer si los fenotipos renales en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ se atribuyen a glucosa en sangre alta o citotoxicidad directa por STZ16.

Teniendo en cuenta el mayor uso de STZ para tratar los TNE, es esencial una comprensión más detallada de los mecanismos subyacentes de la toxicidad renal por STZ para prevenir sus efectos adversos. Aunque ya se han informado hallazgos experimentales sobre la nefrotoxicidad inducida por STZ16,17,18,19, los mecanismos moleculares subyacentes siguen sin estar claros. En el presente estudio, realizamos transcriptómica imparcial en células epiteliales tubulares tratadas con STZ in vitro e in vivo, centrándonos en el daño del ADN y la posterior señalización de p53.

Inicialmente examinamos los fenotipos renales de ocho pacientes con NET tratados con STZ en nuestra institución. La edad promedio y los niveles de creatina sérica fueron 62,0 ± 10,9 años y 0,87 ± 0,12 mg/dl, respectivamente (Tabla complementaria 1). Un paciente desarrolló diabetes después del tratamiento con STZ debido a la resección quirúrgica de un tumor de páncreas. En las comparaciones con los niveles de glucosa en sangre en el momento de la recolección de orina, 7 de 8 pacientes presentaron glucosa urinaria inadecuadamente positiva. Cinco de 7 pacientes y 6 de 7 pacientes presentaron niveles bajos de fósforo sérico y de ácido úrico, respectivamente (Tabla complementaria 1). Se evaluó la histología renal en 2 pacientes. La tinción con PAS y tricrómico de Masson mostró fibrosis intersticial moderada y lesión tubular caracterizada por la pérdida del borde en cepillo y células epiteliales tubulares aplanadas (fig. 1). Dado que el daño en el ADN es una de las principales fisiopatologías entre los efectos citotóxicos inducidos por STZ, realizamos una inmunotinción para γH2AX, un marcador de daño en el ADN. La tinción de γH2AX reveló tinción nuclear positiva en células epiteliales tubulares en pacientes, mientras que no en el control no lesionado (Fig. 1).

Daño al ADN en células epiteliales tubulares en pacientes con tumor neuroendocrino (NET) tratados con STZ. Imágenes microscópicas de muestras de biopsia de riñón humano sometidas a inmunotinción para γH2AX, así como tinción con PAS y tricrómico de Masson. El número de epitelios tubulares γH2AX+ se contó en imágenes de gran aumento de tres pacientes con enfermedad de la membrana basal delgada como control sano y dos pacientes con NET tratados con STZ (n.º 1 y n.º 2). Los datos son medios ± SD. Barra = 50 μm.

Examinamos la respuesta citotóxica a STZ en células NRK52E y descubrimos que STZ reducía la viabilidad celular de manera dependiente de la dosis (Fig. 2a). qPCR reveló que STZ no aumentó la expresión del marcador de lesión tubular proximal Havcr1 (que codifica Kim-1), pero redujo ligeramente la de algunos marcadores epiteliales tubulares maduros Slc34a1 y Lrp2 (que codifican NaPi2a y megalin, respectivamente) (Fig. 2b) . Para identificar la señalización celular responsable de la citotoxicidad de STZ, luego investigamos las diferencias en el transcriptoma entre las células NRK52E tratadas con 10 mM de STZ o vehículo durante 24 h por secuencia de ARN. Un análisis no supervisado de la expresión génica reveló que 266 de los 18 930 genes mostraban una expresión diferencial entre dos grupos (valor de p corregido por tasa de detección falsa < 0,05, cambio de pliegue absoluto > 2) (Fig. 2c).

Regulación positiva de la señalización de p53 en células epiteliales tubulares tratadas con STZ. ( a ) El número de células NRK-52E viables se redujo 24 h después del tratamiento con STZ de manera dependiente de la dosis. ( b ) qPCR de ARN para los marcadores representativos de túbulos lesionados y sanos. ( c ) La secuencia de ARN de las células NRK-52E tratadas con STZ. Los genes resaltados son genes expresados de forma significativamente diferencial incluidos en la vía de señalización de p53. ( d ) Análisis de enriquecimiento de las vías KEGG para genes expresados diferencialmente entre células no tratadas y tratadas con STZ. Se presentan las 10 principales vías KEGG significativamente enriquecidas. ( e ) Western blot de lisados de proteínas de células NRK-52E para γH2AX, fosfo-p53, caspasa-3 escindida y GAPDH. Imágenes representativas de n = 3. ( f ) Las densidades ópticas de γH2AX, fósforo-p53 y bandas de caspasa-3 escindidas se normalizaron frente a las de GAPDH. En todos los grupos, los datos son medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando una prueba t no pareada en (b) y la prueba post hoc de Dunnett se usó para comparaciones múltiples en (f). * p < 0,05.

Anotamos la expresión génica utilizando la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG), e identificamos 12 vías significativamente enriquecidas (valor p de umbral <0.05) (Fig. 2d). La vía de señalización de p53 fue la más altamente regulada en las células tratadas con STZ (Fig. 2d, Fig. 1 complementaria). La transferencia de Western de lisados celulares reveló que STZ regulaba al alza la expresión de γH2AX y la fosforilación de p53 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2e, f).

Para investigar si STZ induce lesión tubular in vivo, inyectamos varias concentraciones de STZ en ratones. Veinticuatro horas después de la inyección de STZ, los niveles de glucosa en sangre disminuyeron (Fig. 3a) y los niveles de insulina en plasma aumentaron en los ratones tratados con la dosis más alta de STZ (Fig. 3b), lo que refleja la liberación de insulina como consecuencia de la muerte de las células β pancreáticas. . Aunque el BUN sérico no difirió entre los grupos experimentales (Fig. 3c), los riñones de los ratones que recibieron una sola inyección de STZ exhibieron una lesión tubular que se caracterizó por la pérdida del borde en cepillo, que fue más grave en los ratones tratados con una dosis más alta. dosis de STZ (Fig. 3d). La qPCR de ARN de riñón completo reveló la disminución de la expresión de los marcadores epiteliales tubulares maduros Slc5a2 (que codifican SGLT2) y el aumento de la expresión de Havcr1 en ratones tratados con STZ (Fig. 3e). También confirmamos una reducción en la inmunotinción para megalina en ratones tratados con STZ (Fig. 3d).

Daño tubular dependiente de la dosis por STZ in vivo. (a) Disminuciones en los niveles de glucosa en sangre en ratones tratados con 200 mg/kg de STZ. (b) Los niveles de insulina en plasma fueron más altos en los grupos de tratamiento con dosis altas de STZ. (c) Los niveles de BUN no difirieron entre los grupos experimentales. ( d ) Las imágenes microscópicas de tejido renal con tinción PAS e inmunotinción para megalina mostraron aumentos en los túbulos con la pérdida del borde en cepillo y disminuciones en la expresión de megalina en ratones tratados con STZ. ( e ) qPCR de ARN de tejido renal para los marcadores representativos de túbulos lesionados y sanos (transportadores de sodio de membrana apical). En todos los grupos, los datos son medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. N = 5 a 7 ratones por grupo. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (c).

Examinamos el daño del ADN epitelial tubular y la posterior activación de p53 in vivo. La inmunotinción para γH2AX reveló tinción nuclear positiva en el tejido renal de ratones tratados con la dosis más alta de STZ (Fig. 4a). La localización de la tinción positiva se limitó a la corteza renal, no a la médula renal (Fig. 4a, b, Fig. 2 complementaria). La tinción de inmunofluorescencia con Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), un marcador del túbulo proximal, mostró que la mayoría de las células positivas para γH2AX se tiñeron conjuntamente con LTL, mientras que la inmunofluorescencia para Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA), un marcador del conducto colector, mostró que las células positivas para γH2AX rara vez co-teñido con DBA (Fig. 4c). Esto indica que el daño del ADN inducido por STZ ocurre predominantemente en los túbulos proximales corticales. Para confirmar el daño en el ADN inducido por STZ y dilucidar el tipo de daño en el ADN en los riñones, realizamos un ensayo cometa de tejido renal completo. El momento de la cola del cometa en condiciones alcalinas (un cometa alcalino) refleja rupturas de doble cadena (DSB) y rupturas de una sola cadena (SSB) del ADN, mientras que en condiciones neutras (un cometa neutral) solo refleja ADN DSB20. Los momentos de cola de cometa alcalina aumentaron en células renales de ratones tratados con STZ de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4a, d). Los momentos neutros de la cola del cometa también aumentaron en las células renales de los ratones tratados con STZ de manera dependiente de la dosis; sin embargo, la diferencia entre estos grupos fue menor para los momentos neutrales de la cola del cometa (Fig. 4d). Este resultado sugiere que el ADN DSB y SSB se produjo en los riñones después de la administración de STZ de manera dependiente de la dosis. También confirmamos la regulación positiva de la expresión de γH2AX y la fosforilación de p53 en lisados de riñón completo de ratones tratados con STZ de manera dependiente de la dosis (Fig. 4e, f).

Daño del ADN dependiente de la dosis por STZ in vivo. ( a ) Imágenes microscópicas de riñones inmunoteñidos para γH2AX e imágenes representativas del ensayo cometa de células renales aisladas de ratones 24 h después del tratamiento con STZ. ( b ) Cuantificación separada de células nucleares γH2AX positivas en la corteza y la médula renales. ( c ) Imágenes de inmunofluorescencia de γH2AX y marcador epitelial tubular proximal (LTL) o marcador del conducto colector (DBA) en ratones tratados con STZ. (d) Un análisis cuantitativo (cometa alcalino: n = 100 cada uno, cometa neutral: n = 50 cada uno). ( e ) Western blot de lisados de tejido renal para γH2AX, fosfo-p53 y GAPDH. Imágenes representativas de n = 3. ( f ) Las densidades ópticas de las bandas γH2AX y fosfo-p53 se normalizaron frente a las de GAPDH. N = 5 a 7 ratones por grupo. En todos los grupos, los datos son medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (a) y 25 μm en (c).

Para evaluar la lesión tubular inducida por STZ en la fase subaguda in vivo, extendimos el período de observación a 7 días después de la inyección de STZ (Fig. 5a). Para distinguir la lesión tubular inducida por glucosa en sangre alta, administramos insulina glargina para reducir los niveles de glucosa en sangre en ratones inyectados con STZ (Fig. 5a, b). Los niveles de insulina en plasma disminuyeron ligeramente en los ratones tratados con STZ, pero no hubo significación estadística (Fig. 5c). El BUN sérico no difirió entre los grupos experimentales (Fig. 5d). Siete días después de la inyección de una dosis única de STZ (150 mg/kg), los riñones de los ratones mostraron lesión tubular con pérdida del borde en cepillo; sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre la inyección de STZ con o sin insulina (Fig. 5e). La inmunotinción para γH2AX reveló una tinción nuclear positiva en STZ con o sin insulina (Fig. 5e, f). La qPCR de ARN de riñón completo reveló una expresión ligeramente disminuida de marcadores epiteliales tubulares maduros (Slc5a2, Slc34a1 y Lrp2) y ningún cambio significativo en la expresión de Havcr1 en ratones tratados con STZ (Fig. 5g). Este resultado indica que la lesión tubular inducida por STZ ocurrió independientemente de los niveles de glucosa en sangre en la fase subaguda.

Glucosa en sangre independiente de lesión tubular por STZ. (a) Esquema experimental. Dos días después del tratamiento con STZ (150 mg/kg), se administró insulina glargina a aproximadamente 200 mg/dl para controlar los niveles de glucosa en sangre y los ratones se sacrificaron el día 7. (b) Los niveles de glucosa en sangre aumentaron en los ratones tratados con STZ. pero disminuyeron con la administración de insulina glargina. ( c, d ) Los niveles de insulina en plasma ( c ) y los niveles de BUN ( d ) no difirieron entre los grupos experimentales. (e) Las imágenes microscópicas de tejido renal teñido con PAS e inmunoteñido para γH2AX mostraron aumentos en los túbulos con la pérdida del borde en cepillo y células positivas para γH2AX nuclear en ratones tratados con STZ con o sin insulina glargina. ( f ) Cuantificación separada de células nucleares γH2AX positivas en la corteza y la médula renales. ( g ) qPCR de ARN de tejido renal para los marcadores representativos de túbulos lesionados y sanos. En todos los grupos, los datos son medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. N = 4 a 5 ratones por grupo. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (e).

Con base en la regulación positiva de la señalización de p53 en la lesión tubular inducida por STZ, examinamos los efectos preventivos de la inhibición farmacológica de p53 por pifitrina-α (Fig. 6a). Estudios previos demostraron que la florizina, un inhibidor de SGLT2, previno la lesión tubular inducida por STZ19. Por lo tanto, también investigamos si la administración previa de dapagliflozina, un inhibidor selectivo de SGLT2, inhibió el daño del ADN inducido por STZ y la lesión tubular posterior (Fig. 6a). Los niveles de glucosa en sangre y los niveles de BUN no difirieron significativamente entre los grupos experimentales (Fig. 6b, d). Los niveles de insulina en plasma aumentaron en ratones tratados con STZ (Fig. 6c). También evaluamos el daño del ADN en los riñones. La inmunotinción para γH2AX reveló que la tinción nuclear positiva inducida por STZ mejoró con dapagliflozina, pero no con pifitrina-α (Fig. 6e, f). El ensayo del cometa mostró que los aumentos en los momentos de la cola del cometa alcalinos y neutros fueron atenuados ligeramente por la dapagliflozina (Fig. 6g, h). También confirmamos que la regulación positiva inducida por STZ de la expresión de γH2AX mejoró con dapagliflozina, pero no con pifitrina-α. Por el contrario, la fosforilación de p53 inducida por STZ mejoró con pifithrin-α y dapagliflozin (Fig. 6i, j).

La inhibición farmacológica de la señalización de p53 y SGLT2 mejoraron el daño del ADN inducido por STZ in vivo. (a) Esquema experimental. Se administró pifithrin-α al mismo tiempo que STZ (150 mg/kg). La dapagliflozina se administró 2 h antes de la STZ. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la administración de STZ. N = 5 a 11 ratones por grupo. (b) Los niveles de glucosa en sangre fueron similares entre todos los grupos experimentales. (c) Los niveles de insulina en plasma fueron más altos en los grupos de tratamiento con STZ. (d) Los niveles de BUN no difirieron entre los grupos experimentales. ( e ) Imágenes microscópicas de tejido renal inmunoteñido con γH2AX. ( f ) Cuantificación separada de células nucleares γH2AX positivas en la corteza y la médula renales. ( g ) Imágenes representativas del ensayo cometa de células renales aisladas de ratones y ( h ) un análisis cuantitativo (cometa alcalino: n = 100 cada uno, cometa neutral: n = 50 cada uno). (i) Western blot de lisados de tejido renal para γH2AX, fosfo-p53 y GAPDH. Imágenes representativas de n = 3. ( j ) Las densidades ópticas de las bandas γH2AX y fósforo-p53 se normalizaron frente a las de GAPDH. En todos los grupos, los datos son las medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (e).

En un análisis histológico, la tinción con PAS de los riñones demostró que la lesión tubular inducida por STZ mejoró con pifithrin-α y dapagliflozin (Fig. 7a). La inmunotinción para megalina mostró que la pifitrina-α y la dapagliflozina conservaron la expresión de megalina en ratones tratados con STZ (Fig. 7a). qPCR reveló disminuciones en la expresión de marcadores epiteliales tubulares maduros (Slc5a2, Slc34a1 y Lrp2) que no cambiaron en ratones tratados con pifitrina-α o dapagliflozina (Fig. 7b). Sin embargo, el aumento de la expresión de Havcr1 por STZ se atenuó ligeramente en ratones tratados con pifithrin-α o dapagliflozin (Fig. 7b).

La inhibición farmacológica de la señalización de p53 y SGLT2 mejoraron la lesión tubular inducida por STZ in vivo. ( a ) Imágenes microscópicas de tejido renal teñido con PAS e inmunoteñido para megalina. ( b ) qPCR de ARN de tejido renal para los marcadores representativos de túbulos lesionados y sanos (transportadores de sodio de membrana apical). En todos los grupos, los datos son las medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. N = 5 a 11 ratones por grupo. * p < 0,05, Bar = 50 μm en imágenes de tinción PAS y 100 μm en imágenes de inmunotinción para megalin en (c).

Con respecto a la futura aplicación clínica de estos fármacos renoprotectores frente a la lesión renal inducida por STZ, evaluamos los efectos de la coadministración de STZ y pifitrina-α o dapagliflozina sobre las células de los islotes pancreáticos. La inmunotinción para γH2AX reveló una tinción nuclear positiva dentro de los islotes en todos los grupos experimentales tratados con STZ (Fig. 8a). El porcentaje de células γH2AX+ fue similar entre los grupos tratados con STZ (Fig. 8b). Este resultado indica que los efectos preventivos de la dapagliflozina sobre el daño del ADN se observaron en los riñones, pero no en el páncreas, que no expresa SGLT2.

STZ indujo daño en el ADN de los islotes pancreáticos. ( a ) Imágenes microscópicas del páncreas inmunoteñidas para γH2AX. Las puntas de flecha indican los núcleos γH2AX+. ( b ) Cuantificación separada de células nucleares γH2AX positivas en islotes pancreáticos. En todos los grupos, los datos son las medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. N = 5 a 11 ratones por grupo. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (a).

El presente estudio investigó los mecanismos subyacentes a la lesión tubular inducida por STZ in vitro e in vivo. Un análisis transcriptómico mostró que la señalización de p53 se activó en células epiteliales tubulares tratadas con STZ. STZ indujo daño en el ADN de las células epiteliales tubulares de forma dependiente de la dosis, y su localización se limitó a la corteza renal. La inhibición farmacológica de p53, así como de SGLT2, redujo la lesión tubular inducida por STZ, mientras que los efectos citotóxicos de STZ en las células de los islotes del páncreas se mantuvieron. Además, el daño del ADN tubular fue evidente en muestras de biopsia renal de pacientes con NET tratados con STZ. En conjunto, estos resultados indican que los mecanismos subyacentes a la entrada de STZ en las células diferían entre las células epiteliales del túbulo proximal y las células β pancreáticas, lo que contribuyó a la diferencia en la respuesta a STZ con la administración conjunta de un inhibidor de SGLT2 o un inhibidor de p53.

Nuestros resultados in vivo revelaron lesión tubular inducida por STZ, incluida la pérdida de transportadores transmembrana, que fue independiente de la glucosa en sangre. Los fenotipos iniciales de la lesión tubular proximal son la pérdida de polaridad celular, la detención del ciclo celular y la disminución de los transportadores de membrana, como NaPi2a y SGLT210,13. En general, cuando los niveles de glucosa en sangre se elevan lo suficiente como para exceder la capacidad de reabsorción de los túbulos proximales, comienza a aparecer glucosuria, típicamente 250-300 mg/dl de glucosa en sangre en controles sanos no diabéticos21. En nuestros pacientes con NET, no hubo evidencia de que los niveles de glucosa en sangre estuvieran lo suficientemente elevados como para provocar la aparición de glucosuria, lo que sugiere alguna anomalía en la capacidad de reabsorción tubular. Además, aunque los hallazgos previos sobre la nefropatía diabética se obtuvieron utilizando un modelo de diabetes tipo 1 inducida por STZ14,15, se subestimó la lesión tubular proximal latente16. Estudios previos mostraron que la detención del ciclo celular así como la disminución de la expresión de SGLT2 ocurrieron después de la administración de STZ22,23,24. Según la regulación positiva compensatoria de SGLT2 para aumentar la reabsorción de glucosa en otros modelos de ratones diabéticos23, la regulación negativa de SGLT2 después de la administración de STZ indica una lesión tubular proximal latente.

Nuestra transcriptómica imparcial reveló que la señalización de p53 estaba regulada al alza en líneas de células epiteliales tubulares tratadas con STZ. También encontramos que STZ indujo la fosforilación de p53 de manera dependiente de la dosis in vivo e in vitro. Es de destacar que, a diferencia de los informes anteriores que demuestran la regulación positiva de p53 en tejidos renales y hepáticos en la fase crónica después del tratamiento con STZ25,26, se encontró que p53 estaba regulada positivamente en el epitelio tubular en la fase aguda después de la administración de STZ. p53, una proteína supresora de tumores, es un componente clave de la respuesta celular al estrés, incluido el daño del ADN, la expresión de oncogenes, la hipoxia, las ROS y la privación de nutrientes27. Después de su fosforilación, p53 se transloca al núcleo y activa transcripcionalmente una amplia gama de genes relacionados con el ciclo celular, la apoptosis, la autofagia y el metabolismo27. Detectamos daños en el ADN dentro de las células epiteliales tubulares de una manera dependiente de la dosis de STZ y demostramos que persistió durante 1 semana después de la inyección de STZ, independientemente de los niveles de glucosa en sangre. Estudios previos identificaron p53 activado en células epiteliales tubulares como un fenotipo de diabetes tipo 1 inducida por STZ28, sin embargo, el daño del ADN inducido por STZ, no la glucosa alta en sangre, puede haber contribuido a estos fenotipos.

En las comparaciones del daño del ADN inducido in vivo por cisplatino y STZ, la diferencia más destacada fue la distribución histológica de las regiones lesionadas en el tejido renal. La región tubular lesionada por el cisplatino se localiza principalmente en la franja exterior del bulbo raquídeo, en la que se encuentra el segmento S3 de los túbulos proximales29. Por el contrario, los presentes resultados demostraron que la lesión tubular inducida por STZ rara vez se detectó en esa región, mientras que estuvo notablemente presente dentro de la corteza exterior en la que se encuentran los segmentos S1 y S2 de los túbulos proximales. Esto respalda nuestra teoría de que STZ ingresa a las células a través de GLUT2 y SGLT2, que se expresan predominantemente en el segmento S1/2 de los túbulos proximales.

Sobre la base de la regulación positiva de la señalización de p53 en la lesión tubular inducida por STZ, la inhibición farmacológica de p53 es una posible estrategia preventiva. Estudios previos demostraron que la señalización de p53 activada juega un papel crucial en la lesión renal en varios modelos de enfermedades, incluida la nefrotoxicidad por cisplatino y la lesión por isquemia-reperfusión30,31,32,33,34,35,36. Sin embargo, los efectos de la inhibición farmacológica o la deleción genética de p53 en la lesión renal son complejos36,37. Estudios previos demostraron que la inhibición de p53 no siempre fue beneficiosa, sino que en realidad exacerbó la lesión tisular o la fibrosis37,38. El tipo de modelo de lesión y la especie animal pueden contribuir a las diferencias observadas en la respuesta de inhibición de p53 frente a la lesión renal37. En la lesión renal inducida por STZ, encontramos que la pifitrina-α no mitigó el daño del ADN; sin embargo, mejoró ligeramente la expresión del marcador de lesión renal. Por lo tanto, la pifitrina-α no pareció prevenir la captación de STZ por las células epiteliales tubulares, mientras que la lesión tubular mediada por la activación posterior de p53 se atenuó hasta cierto punto.

Uno de los principales factores limitantes asociados al uso de fármacos anticancerígenos es su citotoxicidad en tejidos normales, siendo los riñones el órgano diana más frecuente8. Aunque los niveles de creatinina sérica no aumentaron en la mayoría de los pacientes tratados con STZ, la excreción urinaria de glucosa inadecuada indica una lesión tubular proximal latente. En conjunto, los resultados actuales y los hallazgos previos demostraron reducciones marcadas en la expresión de SGLT2 en ratones tratados con STZ19,23, lo que puede contribuir a la excreción de glucosa en orina, mientras que los niveles de glucosa en sangre no aumentaron lo suficiente. Para minimizar la nefrotoxicidad de los fármacos anticancerosos, un enfoque posible es reducir la captación del fármaco en las células renales, siendo ideal el bloqueo específico de los túbulos renales. De acuerdo con hallazgos previos, los presentes resultados mostraron que la inhibición farmacológica de SGLT2 inhibió parcialmente la nefrotoxicidad por STZ19, mientras que se conservaron sus efectos citotóxicos en las células β pancreáticas que no expresan SGLT2. Por lo tanto, un pretratamiento con inhibidores de SGLT2 tiene potencial como enfoque profiláctico específico para la lesión renal.

Existen varias limitaciones en este estudio. Primero, hubo discrepancias entre los resultados experimentales de qPCR in vivo e in vitro, particularmente en la expresión de transportadores transmembrana en el epitelio tubular. Una explicación es que la pérdida de polaridad celular y la pérdida concomitante de expresión de transportadores de membrana, incluido SGLT2, a veces se observan en epitelios tubulares en condiciones de cultivo39,40. Por lo tanto, la expresión in vitro de estas moléculas puede estar subestimada. En segundo lugar, aunque la activación de p53 es una señalización común aguas abajo del daño del ADN después de varios insultos, no pudimos mostrar la activación de p53 en tejido renal humano en pacientes con NET. Por último, si bien demostramos que la dapagliflozina mejoró el daño del ADN inducido por STZ en el epitelio tubular in vivo, sus mecanismos precisos, especialmente si STZ realmente ingresa a las células a través de SGLT2, no se aclaran directamente. Además, mientras que STZ ingresa a las células β pancreáticas a través de GLUT2, un transportador de glucosa bidireccional, la dirección del transporte de STZ mediado por GLUT2 en el epitelio tubular proximal no está clara en nuestros experimentos y requiere más investigaciones en el futuro.

En conclusión, el presente estudio reveló la nefrotoxicidad de STZ in vitro, in vivo y en muestras de biopsia renal de pacientes con TNE. El daño del ADN y la subsiguiente activación de p53 en las células epiteliales tubulares son responsables de la nefrotoxicidad inducida por STZ. Los inhibidores de SGLT2 previnieron el daño del ADN en células epiteliales tubulares in vivo, mientras que se conservó la toxicidad celular contra las células β pancreáticas. Esto sugiere que un pretratamiento con un inhibidor de SGLT2 es una opción preventiva atractiva para los eventos adversos de STZ en el tejido renal en pacientes con NET. Además, dado que la nefrotoxicidad inducida por STZ se ha subestimado en entornos experimentales, la lesión renal en la diabetes tipo 1 inducida por STZ debe evaluarse cuidadosamente.

Inscribimos retrospectivamente a 8 pacientes con NET tratados con STZ en la Universidad de Medicina de la Prefectura de Kioto. Todas las características clínicas se recopilaron de los registros médicos, incluida la edad, el sexo, las complicaciones y los resultados de laboratorio, y se enumeraron en la Tabla complementaria 1. Se obtuvieron muestras de riñón humano de 2 pacientes mediante biopsia renal. Como control, analizamos tejido renal de un paciente con una enfermedad de la membrana basal delgada que afectaba principalmente al glomérulo, no al tejido tubular. La información del paciente se anonimizó y se desidentificó antes de los análisis. Todo el protocolo del presente estudio fue diseñado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Debido a su diseño retrospectivo y de bajo riesgo para los pacientes, el Comité Ético aprobó el uso de la siguiente metodología de exclusión voluntaria. Se eliminó el requisito de consentimiento informado verbal y el consentimiento informado se obtuvo mediante información de acceso general, así como modos fáciles de optar por no participar. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de la Universidad de Medicina de la Prefectura de Kyoto (Número de aprobación: ERB-C-2169, ERB-C-2210).

Se adquirieron ratones macho C57BL/6 de tipo salvaje de Shimizu, Inc. (Kyoto, Japón). El modelo de lesión de STZ se indujo mediante una inyección intraperitoneal de STZ (Cayman Chemical, MI, EE. UU.) en tampón de citrato de sodio 0,05 M, pH 4,5 a una concentración de 100, 150 o 200 mg/kg de peso corporal en ratones macho de la edad de 8 a 10 semanas. Los ratones fueron sacrificados 1 o 7 días después de la inyección de STZ. Se usaron ratones de control compañeros de camada para las comparaciones entre grupos. A todos los grupos tratados con insulina se les inyectó por vía subcutánea insulina glargina (Wako, Osaka, Japón), y luego se ajustaron a la cantidad que mantuvo su nivel de glucosa en sangre en ayunas al mismo nivel (± insulina glargina 2-6 Unidades/kg).

Para inhibir p53 in vivo, se inyectaron por vía intraperitoneal 2,2 mg/kg de pifitrina-α (ab120478, Abcam plc., Cambridge, Reino Unido) justo antes de la inyección de STZ como se describió previamente41. Para inhibir SGLT2 in vivo, se disolvieron 1,0 mg/kg de dapagliflozina (Selleck Biotech Co., Houston, EE. UU.) y se diluyeron con solución salina normal al 75 % (0,9 % p/v de NaCl) y se administraron por sonda 1 h antes del tratamiento con STZ. Los pesos corporales y los niveles de glucosa en sangre se midieron a las 17:00 horas después de 8 h de ayuno. Los niveles de glucosa en sangre se midieron utilizando un glucómetro (Glutest Every, Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd., Aichi, Japón). Los ratones se anestesiaron con isoflurano, se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados y después se obtuvieron muestras de sangre de la vena cava inferior. Los riñones y el páncreas se cortaron en muestras para análisis posteriores.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina de la Prefectura de Kyoto y se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y las Pautas para la realización adecuada de experimentos con animales del Consejo de Ciencias de Japón y las pautas ARRIVE.

Se obtuvieron células epiteliales de riñón de rata normales (células NRK 52E) del JCRB Cell Bank. Las células se cultivaron en DMEM (Wako, Osaka, Japón) que contenía penicilina y estreptomicina al 1 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) y FBS al 5 % (Invitrogen) a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 % y aire al 95 %. Las células se trataron con 1, 5, 10 o 30 mM de STZ disuelto en sulfóxido de dimetilo durante 24 h antes del recuento celular. El número de células se contó usando un contador de células automático ADAM-MC (Digital Bio, Japón) que funciona usando el método de tinción de células muertas con yoduro de propidio.

El nitrógeno ureico en sangre sérica (BUN) se midió usando los métodos enzimáticos apropiados (A667-00, Serotec, Hokkaido, Japón). Las concentraciones de insulina en el plasma recogido se midieron utilizando un kit ELISA de insulina de ratón ultrasensible (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Kanazawa, Japón) según las instrucciones del fabricante.

Se anestesiaron y sacrificaron los ratones, y se extirparon el páncreas y los riñones en los puntos de tiempo indicados. Para preparar secciones de parafina, el laboratorio de Investigación Médica Aplicada (Osaka, Japón) fijó el páncreas y los riñones con paraformaldehído al 4 % y los incrustó en parafina. Los tejidos humanos y de ratón embebidos en parafina se cortaron en secciones de 4 μm de espesor. La tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar.

Después de la desparafinación, las secciones de parafina humana y de ratón se colocaron en una solución tamponada con citrato (pH 6,0) y se hirvieron durante 5 minutos para recuperar los antígenos. La peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno al 3,0 % en metanol durante 20 min. Las muestras se bloquearon con BSA al 3 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpos primarios (Tabla complementaria 2). Las secciones se marcaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo de cabra (ab236469, Abcam). Se usó sustrato cromogénico de diaminobencidina (K3468, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) para la reacción de color, seguido de contratinción con hematoxilina. Todas las secciones se observaron utilizando un microscopio Eclipse E600 (Nikon, Tokio, Japón) y un microscopio BZ-X700/BZ-X710 (Keyence Corporation, Osaka, Japón). Las células positivas para γH2AX se cuantificaron en tres de 10 campos corticales y medulares consecutivos que no se superponen en cada riñón con gran aumento (n = 3). Estos tres campos fueron seleccionados aleatoriamente de forma ciega.

Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones congeladas se rehidrataron y permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 5 min. Las muestras se bloquearon con BSA al 3 % en PBS y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios que se muestran en la Tabla complementaria 2 durante la noche a 4 °C, seguido de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 594 (Tabla complementaria 2) durante 1 h. La contratinción nuclear se realizó con DAPI o DRAQ5 (DR50050; BioStatus, Leicestershire, Reino Unido; 1:2000), seguida de montaje en Prolong-Gold (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía confocal (FV1000; Olympus, Tokio, Japón).

El ARN total se extrajo de la corteza de los riñones o células NRK-52E usando TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) y Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA). Doscientos nanogramos de ARN total se transcribieron inversamente para sintetizar ADNc utilizando un kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara Bio). La detección en tiempo real de los productos de PCR se realizó con KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) y un Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara Bio Inc.). La expresión génica se cuantificó utilizando β-actina como control interno. Los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 3.

Las células NRK52E, una línea celular epitelial tubular proximal de rata, en los grupos STZ se trataron con 10 mM de STZ durante 24 h antes de la extracción de ARN. Las muestras de ARN se proporcionaron a las instalaciones centrales de NGS del Centro de Investigación de Información del Genoma en el Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas de la Universidad de Osaka para la construcción y secuenciación de bibliotecas. La preparación de la biblioteca se realizó con un kit de preparación de muestras de ARNm de cadena TruSeq (Illumina, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina HiSeq 2500 en un modo de extremo único de 100 pb. Las lecturas secuenciadas se asignaron a las secuencias del genoma de referencia de rata (Rnor6) utilizando STAR v 2.7.10a (https://github.com/alexdobin/STAR/) y las lecturas asignadas de forma única se contaron mediante la función FeatureCounts en el paquete Subread (https:/ /subread.sourceforge.net).

Los análisis de datos se realizaron utilizando el software R versión 4.1.2 (https://www.R-project.org/). El paquete edgeR se utilizó para un análisis de expresión diferencial42. Los genes con FDR < 0,05 y un cambio de veces log2 absoluto > 1 se consideraron genes expresados de forma significativamente diferencial. El paquete fgsea se utilizó para un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes. El análisis de ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) se realizó utilizando iDEP versión 0.93 (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep93/) con el enriquecimiento de conjunto de genes de aplicación general para el método de análisis de vías (GAGE)43.

Los extractos de células o tejidos totales se obtuvieron utilizando el tampón de lisis 17 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.). Las proteínas se desnaturalizaron calentándolas a 95 °C durante 5 min y se separaron por SDS-PAGE. Luego, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Immobilon-P IPVH00010: Millipore, MA, EE. UU.). Después de bloquear en leche descremada al 5 % o BSA al 3 % en TBS/Tween20 al 0,1 % a temperatura ambiente durante 1 h, la membrana se incubó con el anticuerpo primario (Tabla complementaria 2) a 4 °C durante la noche. Después de lavar con TBS/Tween20 al 0,1 %, se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa secundaria (7074S; Cell Signaling Technology, Boston, MA; 1:3000 a temperatura ambiente). La quimioluminiscencia se detectó utilizando un reactivo de detección de transferencia Western ECL select (RPN2235: GE Healthcare UK Ltd, Amersham Place, Inglaterra) o sustrato ECL occidental Clarity Max (1,705,062: Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.). Las intensidades de la señal se evaluaron utilizando el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD).

El ensayo del cometa se realizó con el kit de ensayo del cometa (Abcam ab238544) como se describió anteriormente41,44. En resumen, se extrajeron riñones de ratón y se picaron en una pequeña cantidad de PBS enfriado con hielo que contenía EDTA 20 mM. El sobrenadante se pasó a través de un filtro celular de 35 μm. Después de la centrifugación, el sedimento se suspendió a 1 × 105 células/ml en PBS enfriado con hielo. Las muestras se mezclaron con agarosa cometa en una proporción de 1/10 (v/v) y luego se transfirieron a portaobjetos de vidrio cubiertos con una capa base de agarosa cometa. Después de incubar con tampón de lisis enfriado previamente, los portaobjetos se sometieron a electroforesis. La electroforesis se realizó en solución de electroforesis alcalina para el ensayo de cometa alcalino y solución de electroforesis TBE para el ensayo de cometa neutral. Después de la electroforesis, los portaobjetos se incubaron con tinte de ADN Vista Green. Las imágenes se obtuvieron mediante microscopía de epifluorescencia (IX71; Olympus, Tokio, Japón) utilizando el filtro FITC. Se tomaron al azar diez imágenes (5-15 células por imagen) y se calculó el momento de la cola (longitud de la cola × cola % ADN/100) de 100 células por grupo utilizando el software de análisis Comet Score (TriTek Corp.).

Los resultados se expresan como la media ± error estándar (SE). Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t no pareada para comparaciones de dos variables y un análisis de varianza y la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones de múltiples variables. Los valores de p < 0,05 se consideraron significativos.

Los datos de RNA-seq para todas las muestras se depositaron en Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE215337. Token seguro para acceso de revisor: gzanqiemjhyhdyl.

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NK y TK diseñaron el estudio, realizaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. YK analizó los datos. MU, AM, HY-S., YS, YM, NO-O., IN, TN, AY-T., NU-W., TI, NY, MK, EK, HY, SM y KT contribuyeron a la discusión .

Correspondencia a Tetsuro Kusaba.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Nakai, K., Umehara, M., Minamida, A. et al. La estreptozotocina induce lesión tubular proximal renal a través de la activación de la señalización de p53. Informe científico 13, 8705 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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Recibido: 24 noviembre 2022

Aceptado: 24 de mayo de 2023

Publicado: 29 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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La estreptozotocina induce lesión tubular proximal renal a través de la activación de la señalización de p53